原核表達(dá)載體現(xiàn)貨供應(yīng)

　　原核表達(dá)載體指：能攜帶插入的外源核酸序列進(jìn)入原核細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的載體。

  

 

編輯本段原核表達(dá)載體調(diào)控原件

1.啟動(dòng)子

　　啟動(dòng)子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并起始RNA合成的序列，它是基因表達(dá)*的重要調(diào)控序列。沒有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。由于細(xì)菌RNA聚合酶不能識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子，因此原核表達(dá)載體所用的啟動(dòng)子必須是原核啟動(dòng)子。 原核啟動(dòng)子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成，對(duì)mRNA的合成極為重要。在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游5～10 bp處，有一段由6～8個(gè)堿基組成，富含A和T的區(qū)域，稱為Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10區(qū)。來源不同的啟動(dòng)子，Pribnow 盒的堿基順序稍有變化。在距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35 bp處，有一段由10 bp組成的區(qū)域，稱為-35區(qū)。轉(zhuǎn)錄時(shí)大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子。-35區(qū)與RNA聚合酶s亞基結(jié)合，-10區(qū)與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近DNA被解旋形成單鏈，RNA聚合酶使*和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵，以后在RNA聚合酶作用下向前推進(jìn)，形成新生的RNA鏈。 原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動(dòng)子有Lac（乳糖啟動(dòng)子）、Trp（色氨酸啟動(dòng)子）、Tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子） 、lPL （l噬菌體的左向啟動(dòng)子）、T7噬菌體啟動(dòng)子等。

2. SD序列

　　1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)，在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp處的由3～9 bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是核糖體RNA的識(shí)別與結(jié)合位點(diǎn)。以后將此序列命名為Shine-Dalgarno序列，簡(jiǎn)稱SD序列。它與起始密碼子AUG之間的距離是影響mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白的重要因素之一，某些蛋白質(zhì)與SD序列結(jié)合也會(huì)影響mRNA與核糖體的結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯。另外，真核基因的第二個(gè)密碼子必須緊接在ATG之后，才能產(chǎn)生一個(gè)完整的蛋白質(zhì)。

3．終止子

　　在一個(gè)基因的3¢末端或是一個(gè)操縱子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有終止轉(zhuǎn)錄功能，這一序列稱之為轉(zhuǎn)錄終止子，簡(jiǎn)稱終止子（terminator）。轉(zhuǎn)錄終止過程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進(jìn)，RNA的延伸也停止在終止信號(hào)上，完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來。對(duì)RNA聚合酶起強(qiáng)終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點(diǎn)，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G/C的區(qū)域，G/C富含區(qū)域又具有回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)。這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且有與A/T富含區(qū)對(duì)應(yīng)的一串U。轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制較為復(fù)雜，并且結(jié)論尚不統(tǒng)一。但在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，防止克隆的外源基因表達(dá)干擾載體的穩(wěn)定性，一般都在多克隆位點(diǎn)的下游插入一段很強(qiáng)的rrB核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子。

編輯本段原核表達(dá)載體構(gòu)建

1.獲得目的基因

　?。?）通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

　?。?）通過RT-PCR方法：提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA*鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

2.構(gòu)建重組表達(dá)載體

　?。?）載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

　　（2）PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

3. 獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

　?。?） 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。

　　（2）測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。

　　（3） 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。