尼龍毛柱使用方法

上海起發(fā)實驗試劑有限公司尼龍毛/尼龍毛柱專業(yè)代理

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尼龍毛柱?操作方法：

　1.秤取1.5g尼龍毛裝入20-30ml玻璃容器或注射器內(nèi)，填料的體積控制在15毫升左右。因為尼龍毛的松緊關(guān)系到T細(xì)胞的回收率，所以要特別注意。注射器下端配接5厘米左右長的帶有彈簧夾的橡皮管。

   2. 加入大量的PBS平衡柱子后，用鋁箔包裹，并置于適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)，高壓滅菌15分鐘。

（商品化尼龍毛柱以上步驟可以省略，經(jīng)過PBS平衡后可以直接進(jìn)行下列步驟。）

　3. 滅菌的尼龍毛柱垂直固定后放于超凈臺內(nèi)，頂部以鋁箔覆蓋，避免污染。

　4. 注射器下端，橡皮管，彈簧夾用*消毒。打開彈簧夾調(diào)節(jié)流速在大約3-4ml/min。

　5.首先，加入3-4倍柱體的無血培養(yǎng)基平衡，之后加入相同體積的含有血清的培養(yǎng)基平衡（上述培養(yǎng)基都要預(yù)熱），zui后等培養(yǎng)基液面接近柱填料液面時，關(guān)閉彈簧夾。

　6. 樣本細(xì)胞懸浮液濃度控制在約5×108cells/ml，上樣量一般是1/3-1/5柱體積。樣品加入之后，再加入少量培養(yǎng)液，然后關(guān)閉彈簧夾。

　7.覆蓋鋁箔，垂直固定，置于消毒過的容器中，于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育1小時。此過程中柱子必須要保持垂直狀態(tài)。

　8. 從培養(yǎng)箱中拿出柱子，置于超凈臺內(nèi)，除去鋁箔。接上按照4.中的方法消毒的彈簧夾和橡皮管，加入適當(dāng)體積經(jīng)37℃預(yù)熱的培養(yǎng)基，打開彈簧夾控制流速在3-4 mL/min，流出約5ml之后，流出的培養(yǎng)液基變得不透明，此時其中含有T細(xì)胞，收集這一部分培養(yǎng)基。

　9. 基本上何時結(jié)束收集取決于流出液體中細(xì)胞的濃度，實際上，收集的量達(dá)到一個柱體積時就可以停止收集，因為即使收集更多的量，回收率幾乎不會增加。

　10.上述操作后，細(xì)胞的

　回收率為： 15~20 %

    T細(xì)胞含量： 85~95 %

　B細(xì)胞污染率： 1 5 %

　多數(shù)細(xì)胞被確定為T細(xì)胞。

       （注）收集粘附于尼龍毛上的細(xì)胞時，將T細(xì)胞收集完畢后的尼龍毛再無菌操作的狀態(tài)下取出，轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，用鑷子小心的將尼龍毛松開，粘附的細(xì)胞可以洗到培養(yǎng)基中。或者將注射器芯插入注射器內(nèi)，通過壓力使的粘附的細(xì)胞隨著液體流出。

尼龍毛柱是免疫學(xué)中一種用于分離T細(xì)胞的分離柱。憂郁在研究體內(nèi)及體外的免疫系統(tǒng)時，分離淋巴細(xì)胞群是一個關(guān)鍵步驟。而市場上并沒有針對B細(xì)胞的特異性抗血清，所以分離淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞并不是十分方便。T細(xì)胞尼龍毛分離法利用了尼龍毛對B細(xì)胞的親和力，從而使T細(xì)胞在沒有嚴(yán)重?fù)p傷的情況下達(dá)到的足夠的純度。該方法不像流式和磁珠費(fèi)用昂貴，而且操作簡便，所需要的條件也不高，是一種非常實用的方法。

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