proteinslides Ni-NTA或Cu-NTA表面

proteinslides Ni-NTA或Cu-NTA表面

應用說明： 

蛋白質分子僅通過具有受控方向的poly-His標簽連接到表面，否則將盡可能遠離表面。這確保了天然狀態的蛋白質活性。無需樣品預純化。

圖1.零背景Cu2 +表面由束縛在高密度PEG涂層上的螯合Cu2 +離子組成。蛋白質分子通過多組氨酸標簽特異性連接。

重組蛋白通常與聚組氨酸（His）標簽一起產生，以促進純化。這些蛋白質現在用于蛋白質微陣列的制造中。為了利用poly-His標簽的可利用性，我們基于零背景PEG涂層開發了一種螯合的Cu2 +表面，如圖1所示。該表面的使用基本上省去了純化步驟，并將其直接摻入了蛋白質固定化過程，即可以將粗裂解物直接用于微陣列制造，如圖2所示的綠色熒光蛋白（GFP）。除了N末端或C末端的多組氨酸標簽外，由于PEG環境的排斥性，每個固定的蛋白質分子都遠離表面并使其與表面的相互作用小化。結果是，對蛋白質天然構象的干擾小。化學環境的惰性和可控的取向都為固定的蛋白質分子保留其天然構象和活性提供了理想的環境，如圖3所示。對于6xHis標記的磺基轉移酶和堿性磷酸酶，可控的取向固定在Cu2 + / PEG表面，其活性與溶液相幾乎相同。為了進行比較，以無規取向固定在3-氨丙基三乙氧基硅烷（γ-APS）涂層表面上的酶僅顯示約10％的活性。化學環境的惰性和可控的取向都為固定的蛋白質分子保留其天然構象和活性提供了理想的環境，如圖3所示。對于6xHis標記的磺基轉移酶和堿性磷酸酶，可控的取向固定在Cu2 + / PEG表面，其活性與溶液相幾乎相同。為了進行比較，以無規取向固定在3-氨丙基三乙氧基硅烷（γ-APS）涂層表面上的酶僅顯示約10％的活性。化學環境的惰性和可控的取向都為固定的蛋白質分子保留其天然構象和活性提供了理想的環境，如圖3所示。對于6xHis標記的磺基轉移酶和堿性磷酸酶，可控的取向固定在Cu2 + / PEG表面，其活性與溶液相幾乎相同。為了進行比較，以無規取向固定在3-氨基丙基三乙氧基硅烷（γ-APS）涂層表面上的酶僅顯示約10％的活性。

圖3.溶液相中酶活性與在γ-APS表面上隨機取向或在Cu2 + / PEG表面上受控取向的酶活性的比較。	圖2.左側顯示了吸附在螯合的Cu2 + / PEG表面的6xHis標簽的GFP的固有熒光。該表面可抵抗沒有His標簽的GFP的非特異性吸附（右）。光斑直徑約0.2毫米。

Cu2 + / PEG表面上的排斥性2D化學環境不僅對固定化蛋白分子的活性至關重要，而且對維持和恢復這種活性也至關重要。后者在固定在三個不同表面上的6xHis-GFP變性和重新折疊的重復循環后的熒光顯微鏡圖像中得到證明（圖4）：（a）Cu2 + / PEG表面；（b）Cu 2+離子螯合在3-氨基丙基三乙氧基硅烷（gama-APS）功能化表面的表面亞氨基二乙酸基團上；（c）用于非特異性蛋白質吸附的γ-APS表面。盡管免疫染色顯示相似量的GFP，但三個表面的固有熒光強度卻有很大差異。Cu2 + / gamma-APS或gamma-APS表面的熒光強度為70％或< Cu 2+ / PEG表面的20％。盡管在變性步驟之后所有三個表面上均未檢測到熒光，但重新折疊的結果是表面化學性質的強函數。在Cu2 + / PEG表面上，大多數熒光強度在重折疊步驟后得以恢復。相反，Cu2 + /γ-APS或γ-APS表面幾乎沒有熒光強度。在Cu2 + / PEG表面上，每個固定的GFP分子僅通過6xHis標簽連接，但由于PEG功能的排斥性，更傾向于遠離表面。表面的這種排斥或不結垢的性質確保了弱的蛋白質-表面相互作用不會在能量格局中為蛋白質重新折疊引入額外的障礙。在gamma-APS表面上，GFP與附近的“粘性”或結垢–NH2官能團之間存在吸引人的非特異性相互作用。變性后，與粘性環境的這種非特異性相互作用有望增加，從而有效地在能量格局中引入了無法克服的障礙，從而使蛋白質重新折疊。Cu2 + / PEG表面對蛋白質分子進行芯片重折疊的能力為許多潛在應用打開了大門，例如，直接在芯片上生成蛋白質微陣列，從重組蛋白質中去除包涵體等。這些涂層可供選擇在標準顯微鏡載玻片，蓋玻片和硅片上。我們的客戶已成功將Cu2 + / PEG表面應用于各種應用，包括蛋白質傳感器，蛋白質微陣列，單分子光譜，生物原子力顯微鏡和其他生物物理研究。即將推出：Cu2 + / PEG表面的三維（3D）版本正在開發中。微孔3D涂層提供的大表面積允許高聚His標簽探針分子的高負載。這是檢測極低濃度生物標志物的理想選擇。

圖4.在三個表面上變性（De）和再折疊（Re）循環前后的6xHis-GFP熒光顯微鏡圖像：（a）Cu2 + / PEG；（b）Cu2 //γ-APS；（c）γ-APS。變性涉及將6xHis-GFP涂層的表面浸入pH = 3.5的緩沖溶液中，而重新折疊對應于將樣品與含有1xPBS，20％蔗糖和10％甘油的pH = 8.1的緩沖溶液一起孵育。

閱讀使用我們的Cu2 +表面發表的文章：蛋白質組學，2005，5，416；蛋白質組學，2007，7，1771; 自然方法，2008，5，507; BMC Biotech。，2009，1.等。