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來自Atlantic Cod的Cod Uracil-DNA糖基化酶（Cod UNG）是僅有可商購的UNG酶，其通過適度熱處理*且不可逆地滅活。該酶在含有修飾的Cod UNG基因的重組大腸桿菌（ung-）菌株中產生。
Product information | Article no. | Notes | Price |
Cod UNG – Pack size: 100 U quantity | Pack size: 100 UConc.: 1U/µl | #70500-201 | €92 |
Cod UNG Triton FREE – Pack size: 100 U quantity | Triton FREE | #70501-201 | €92 |
Cod UNG – Pack size: 1000 U quantity | Pack size: 1000 UConc.: 1U/µl | #70500-202 | €390 |
Cod UNG Triton FREE – Pack size: 1000 U quantity | Triton FREE | #70501-202 | €390 |
N/A | Pack size: 50 kUConc.: 50U/µl | #70500-150 | REQUEST QUOTE |
N/A | Pack size: 50 kUConc.: 1U/µl | #70500-151 | REQUEST QUOTE |
N/A | Glycerol-free | #70510-105 | REQUEST QUOTE |
N/A | Glycerol-free | #70510-150 | REQUEST QUOTE |
N/A | Pack size: 200 kUConc.: 50U/µl | #70500-160 | REQUEST QUOTE |
PCR的高靈敏度，特別是qPCR，使得該方法易于污染，產生錯誤或不準確的結果。來自先前PCR的攜帶污染物被認為是假陽性結果的主要來源之一。由于氣溶膠，污染移液管，表面，手套和試劑，污染物可能從先前的擴增反應中帶走。
在擴增DNA和RNA時，有兩種常見的策略可以防止污染物。一個是設置一個單獨的實驗室進行設置和放大，大限度地減少移液步驟的數量，并防止擴增后管子打開。然而，由于實際原因，這并不總是可行的。此外，它無法保證避免污染。
防止污染的另一種常見的策略是在PCR擴增期間用dUTP部分或*替代dTTP，從而產生含有尿嘧啶的DNA。在開始PCR之前，用尿嘧啶-DNA糖基化酶（UNG）處理PCR混合物。在初的變性步驟期間，溫度升高至95℃，導致脫嘧啶位點的裂解和攜帶DNA的片段化。由于模板含有胸苷，因此不受UNG處理的影響。所有PCR都是用dUTP替代dTTP進行的先決條件。
使用我們的Cod UNG的好處是它在55?C時不可逆轉地滅活。Cod UNG是僅有兼容一步式RT-qPCR的UNG！
在逆轉錄酶qPCR（RT-qPCR）中，RNA是初始模板。然而，污染物的問題在這里可能與常規PCR一樣多。逆轉錄后，cDNA是PCR的模板。如果您的樣品被先前PCR的PCR產物污染，則引物無法區分cDNA和DNA，從而導致錯誤結果。
在一步法RT-qPCR試劑盒中，將RNA加入含有逆轉錄酶和聚合酶的主混合物中，使cDNA合成和qPCR在同一試管中。 大腸桿菌 UNG / UDG的宜工作溫度可達約。50?C并且通常保持其活性達到約。70℃。該溫度范圍與一步法RT-qPCR方案中的殘留預防不相容，因為 大腸桿菌 UNG / UDG將在逆轉錄期間去除摻入cDNA中的尿嘧啶，從而導致模板降解。
來自ArcticZymes的重組表達的Cod UNG初是從冷適應生物大西洋鱈魚中分離的。Cod UNG在20?C至40?C的溫度范圍內具有高活性，在溫度高于42?C時會迅速失去活性，并且在55?C時已經不可逆轉地失活。由于Cod UNG的宜溫度范圍與大腸桿菌相比要低得多 UNG / UDG，Cod UNG兼容單管RT-qPCR。通過添加Cod UNG至終濃度0.01U /μl簡單地進行殘留預防，并在開始RT-qPCR之前在25℃引入5分鐘的孵育步驟。或者，可以將濃度增加至0.04U /μl并省略預孵育步驟。Cod UNG將有效去除樣品設置和循環儀升溫過程中的殘留污染。
在這里，我們顯示Cod UNG可用于在含有dUTP而非dTTP的商業一步法RT-qPCR主混合物中進行殘留物預防。用Cod UNG處理不影響靶cDNA，產生與未處理樣品相同的Cq值。為了比較，用通用UNG處理導致顯著的Cq延遲，證明與一步RT-qPCR不相容。
Cod UNG與一步式RT-qPCR兼容 |
| 圖1. Cod UNG與一步法RT-qPCR中的通用UNG相比較。進行一步RT-qPCR，將Cod UNG和通用UNG與未處理的對照進行比較。用Cod UNG處理不影響靶cDNA，產生與未處理樣品相同的Cq值。用通用UNG處理導致顯著的Cq延遲，證明與一步RT-qPCR不相容。 |
Cod UNG有效去除殘留的擴增子 |
| 圖2. Cod UNG有效去除DNA。在進行一步RT-qPCR之前，將含有尿嘧啶的DNA的加標引入RNA樣品中。沒有引入預孵育步驟。用Cod UNG治療成功地將加標的擴增子移除至檢測限以下。 |
熱敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是來源于嗜冷海洋細菌經大腸桿菌表達純化的的重組蛋白，又稱南極熱敏UDG。該熱敏UDG酶能有效地水解單鏈或雙鏈 DNA 上的尿嘧啶，產生的缺嘧啶位點，在高溫或高 pH 下，極易水解斷裂。該酶對RNA無活性，主要用于PCR擴增產物的防污染。大腸桿菌來源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶較為耐熱，經95℃10min處理仍會殘留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，導致含有dU堿基的PCR產物的降解。而來源于嗜冷海洋細菌的熱敏UDG在50℃ 5min即*失活，在進行PCR擴增前，在PCR混合液中添加尿嘧啶-DNA 糖基化酶（熱敏性），25℃10min即可消除PCR產物的殘留污染，由于尿嘧啶-DNA 糖基化酶（熱敏性）在PCR循環的94℃變性一步便可被滅活，因此不會影響新的含dU的PCR產物。
應用 | ||
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活性定義 | ||
| 在標準反應體系下，37°C每分鐘催化 60 pmol 尿嘧啶從含尿嘧啶的雙鏈 DNA 上釋放所需要的酶量為一個活性單位。 | ||
反應buffer | ||
| Heatlabile Uracil DNA Glycosylase (UDG)與絕大多數的PCR 聚合酶反應緩沖液都是兼容的，但在高離子濃度(>100mM)下活性會受到抑制。 | ||
酶保存液 | ||
| 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, , 50% Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。 | ||
儲存 | ||
| -20℃可保存2年，避免反復凍融。 | ||
熱失活 | ||
| 50℃，10min。 |
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