PhyNexus 蛋白質(zhì)A PhyTip列 說(shuō)明書(shū)

PhyNexus在一直是行業(yè)的*,一直為廣大科研客戶(hù)提供zui為的產(chǎn)品和服務(wù),上海起發(fā)一直秉承為中國(guó)科研客戶(hù)帶來(lái)的產(chǎn)品，的服務(wù)，為了給廣大科研客戶(hù)帶來(lái)更加完善的產(chǎn)品和服務(wù),您的滿(mǎn)意將是我們zui大的收獲

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Douglas Gjerde于2002年在加利福尼亞州的圣何塞市建立了PhyNexus公司，以調(diào)查蛋白質(zhì)樣品制備的需求。專(zhuān)欄和機(jī)器人被開(kāi)發(fā)小型化和自動(dòng)化過(guò)程，當(dāng)保留蛋白質(zhì)的自然狀態(tài)時(shí)。2005年，引進(jìn)了一整列的專(zhuān)欄和機(jī)器人。在接下來(lái)的幾年中，柱子被修改為與所有主要的機(jī)器人液體處理器兼容。定期提供超過(guò)20種色譜柱的化學(xué)品，提供超過(guò)100種定制包裝的產(chǎn)品。從2016年開(kāi)始，引入了試劑盒和儀器，大大增加了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的可用性。PhyNexus客戶(hù)是制藥公司和學(xué)術(shù)界的生命科學(xué)家。

PhyNexus開(kāi)發(fā)了一種*的微型工程蛋白質(zhì)和抗體純化技術(shù)，使研究人員能夠定期純化和富集樣品量達(dá)1 mL。PhyTip™色譜柱的*設(shè)計(jì)允許低至10μL的洗脫體積，從而產(chǎn)生高達(dá)50倍的富集因子，純化蛋白濃度可達(dá)5 mg / ml。

純化和富集過(guò)程是一個(gè)簡(jiǎn)單的三步技術(shù)，首先捕獲感興趣的蛋白質(zhì)，然后純化并zui終富集。整個(gè)過(guò)程可能需要不到15分鐘，以產(chǎn)生高濃度的全功能蛋白質(zhì)，以備進(jìn)一步分析。

蛋白A PhyTip柱顯示功能性抗體（IgG）的高結(jié)合親和力和高容量親和力純化。

• 70-90％的IgG回收率
• 獲得高度濃縮的純化蛋白質(zhì)
• 顯示蛋白A PhyTip柱可以從不同水平的背景蛋白中提取非常高純度的IgG蛋白

蛋白質(zhì)A PhyTip列

具有蛋白A的PhyTip色譜柱已針對(duì)特定的PhyNexus試劑和儀器流速/體積進(jìn)行了優(yōu)化，如下所示。這些信息是使用PhyNexus純化系統(tǒng)收集的。所有含蛋白A的PhyTip色譜柱均配有推薦的PhyTip緩沖液，包括：捕獲緩沖液 - 適用于需要添加額外緩沖液以補(bǔ)充樣品體積并確保捕獲正確pH的情況。清洗緩沖液I - 磷酸鹽緩沖液pH 7.4清洗緩沖液II - 鹽水溶液。注意：無(wú)緩沖能力以確保有效洗脫富集緩沖液 - 用于zui終洗脫步驟 - 磷酸鹽緩沖液pH 2.5中和緩沖液。 - Tris緩沖液pH9.0注意：濃縮緩沖液以4mL的pH2.5磷酸鹽緩沖液提供，

含蛋白A樹(shù)脂的200多個(gè)PhyTip色譜柱：

對(duì)于含有1mg BSA的5μgIgG2a（抗FITC MAb。）的200μL樣品，使用下述條件進(jìn)行處理，在zui終樣品體積中回收大于40％的原始IgG質(zhì)量。另外，通過(guò)用考馬斯（Coomassie）檢測(cè)的SDS-PAGE測(cè)定，回收的IgG超過(guò)95％純。

捕獲：通過(guò)以250μL/分鐘的流速通過(guò)樹(shù)脂床4個(gè)循環(huán)捕獲200μL樣品。

純化：將200μL的PhyNexus蛋白A洗滌緩沖液I以500μL/ min的流速通過(guò)樹(shù)脂床兩個(gè)循環(huán)，接著用洗滌緩沖液II再次洗滌，在樹(shù)脂床上流過(guò)兩個(gè)循環(huán)速率500μL/ min。

富集：用10μLPhyNexus A蛋白富集緩沖液將蛋白質(zhì)洗脫至溶液中，以500μL/ min的流速通過(guò)樹(shù)脂床5個(gè)循環(huán)。用3μLPhyNexus蛋白A中和緩沖液中和。

所運(yùn)送的蛋白G富集緩沖液包含：111mM NaH 2 PO 4，14.8mM H 3 PO 4中的140mM NaCl，pH 3.0

含蛋白A樹(shù)脂的1000+ PhyTip色譜柱：

對(duì)于含有5mg BSA的10μgIgG2a（抗-FITC MAb。）的500μL樣品，使用下述條件進(jìn)行處理，在zui終樣品體積中回收大于40％的原始IgG質(zhì)量。另外，通過(guò)用考馬斯（Coomassie）檢測(cè)的SDS-PAGE測(cè)定，回收的IgG超過(guò)95％純。

捕獲：以250μL/分鐘的流速通過(guò)樹(shù)脂床捕獲500μL樣品四個(gè)循環(huán)。

純化：將1000μL的PhyNexus蛋白G洗滌緩沖液I以500μL/ min的流速通過(guò)樹(shù)脂床兩個(gè)循環(huán)，接著用洗滌緩沖液II再次洗滌，以流速500通過(guò)樹(shù)脂床兩個(gè)循環(huán)μL/分鐘。

富集：用15mL PhyNexus蛋白A富集緩沖液將蛋白洗脫到溶液中，以500μL/ min的流速通過(guò)樹(shù)脂床5個(gè)循環(huán)。用5μLPhyNexus蛋白A中和緩沖液中和。

蛋白APhyTip®色譜柱的性能特征和分析步驟

介紹

PhyNexusPhyTip®色譜柱是創(chuàng)新性的純化工具，從根本上簡(jiǎn)化了各種來(lái)源的蛋白質(zhì)的捕獲，純化和富集。這些凈化工具成功的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)保留親和樹(shù)脂床的機(jī)制，具有zui小的死體積和zui大的捕獲潛能。一組PhyTipcolumn結(jié)合蛋白A在特定的*條件下特異性結(jié)合來(lái)自不同來(lái)源的抗體（IgG），因此可以去除核酸和其他污染物。快速洗滌步驟后，純化的抗體很容易用常用的低pH緩沖液洗脫。該技術(shù)允許特異性的高產(chǎn)量的IgG，取決于各種條件，并且提供在非常高濃度的載體蛋白如BSA存在下的高度選擇性純化。PhyTip色譜柱具有*的結(jié)合能力，可以結(jié)合大于100μg的IgG，并且可以有效地回收少至200 ng的IgG - 代表幾乎三個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍。PhyTip色譜柱非常適合從雜交瘤上清液進(jìn)行抗體篩選，或用于高通量提取和純化親和標(biāo)記蛋白質(zhì)。

績(jī)效和分析程序

IgG以高親和力和特異性結(jié)合蛋白A. 這種相互作用的強(qiáng)度和選擇性使蛋白質(zhì)A能夠有效地從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中純化出IgG。為了檢查用蛋白A樹(shù)脂的PhyTip柱的性能，測(cè)量了使用1000個(gè)蛋白A PhyTip柱的純化IgG（抗FITC-MAb）的回收百分比。

材料和方法

樣品：在0.5ml 
含有5mg BSA的PBS中的10μgmFITC-MAb（IgG2a亞類(lèi)）或
2.含有10％FBS（胎牛血清）的DMEM或
3.含有5mg BSA的SFM（無(wú)血清培養(yǎng)基）
樣品處理：使用以下方案在半自動(dòng)ME 1000平臺(tái)上處理所有樣品：

1. （1）捕獲：通過(guò)使樣品在樹(shù)脂床上以2個(gè)輸入/輸出循環(huán)（以0.6ml @ 0.25ml / min的體積設(shè)定）捕獲特定蛋白質(zhì)。
2. （2）純化：通過(guò)用0.5mL PBS（洗滌緩沖液I）洗滌結(jié)合的蛋白質(zhì)/親和樹(shù)脂，使用1進(jìn)/出循環(huán)（體積設(shè)定為0.6ml，0.5ml / min）除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，隨后是1進(jìn)/出循環(huán)（體積程序?yàn)?.6ml，0.5ml / min）和0.5ml鹽水溶液（洗滌緩沖液II）。
3. （3）富集：用15μLpH 3.0洗脫緩沖液以4次輸入/輸出循環(huán)洗脫IgG2a（體積程序?yàn)?.1-0.15ml @ 1ml / min）。一旦洗脫，加入5μL中和緩沖液。請(qǐng)注意，PhyNexus提供的蛋白A和蛋白G PhyTip色譜柱的當(dāng)前洗脫緩沖液的pH值為2.5，目前的中和緩沖液的pH值為9.0。

定量程序

（1）為了制備還原的IgG2a，將15μlzui終洗脫體積與5μl新鮮制備的TCEP（15μl10mg / ml TCEP的水溶液，終體積30μl）反應(yīng)。

（2）使用HP 1050HPLC系統(tǒng)將20μl還原的IgG2a注射到無(wú)孔聚苯乙烯二乙烯基苯反相（C-18）柱中。溶劑A（0.1％TFA的水溶液）和溶劑B（0.1％TFA的ACN溶液）之間的梯度為25％至75％，使用5分鐘。檢測(cè)：在214和280nm處的UV。

3. （3）大約3.18和3.34分鐘時(shí)洗脫主要的IgG2a峰。在這兩個(gè)峰下面的區(qū)域在每種情況下從（3.13-3.5）分鐘積分，相應(yīng)的峰面積在214nm處記錄。
4. （4）在相同的反應(yīng)條件下將TCEP處理的IgG2a標(biāo)準(zhǔn)物加載到柱子中并用作回收計(jì)算的輸入或標(biāo)準(zhǔn)。

IgG2a恢復(fù)的結(jié)果

在DMEM + 10％FBS中的回收率=在SFM + 5mg BSA中的77％回收率= 64％。

已知載體蛋白如白蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并有助于產(chǎn)生良好的抗體，所以當(dāng)抗體產(chǎn)生時(shí)其通常以高量存在。因此，任何純化和富集程序必須能夠耐受高濃度的白蛋白。另外，上面顯示的結(jié)果似乎表明高背景蛋白質(zhì)濃度（例如BSA）的存在可能對(duì)回收率具有有益的影響。

載體蛋白存在下IgG2a回收率的重現(xiàn)性

為了驗(yàn)證載體蛋白在zui大IgG2a回收率中的作用，并證實(shí)重現(xiàn)性，從多個(gè)樣品（n = 4）中從PBS（以及含有5mg BSA的PBS）純化IgG2a。結(jié)果表明在存在500倍過(guò)量的BSA濃度的情況下提高了純化的IgG2a的恢復(fù)（至少20％或更多），并且該程序也是高度可重現(xiàn)的。

在PBS中回收= 42.25％（SD = 4.66％）在PBS中回收+ 5mg BSA = 66.5％（SD = 7.5％）

選擇性性能和分析程序

為了表征和驗(yàn)證蛋白A-IgG親和相互作用的選擇性，將5mg BSA作為載體蛋白加入到0.5ml樣品體積（333倍過(guò)量）中的15μgIgG中。使用蛋白A PhyTip柱處理樣品。

材料和方法

樣品：在含有5mg BSA（10mg / ml或1％w / v BSA）的0.5ml PBS或PBS中的15μgmFITC-MAb（IgG2a亞類(lèi)）。樣品處理：如上所述的恢復(fù)性能和分析程序。

IgG定量和純度分析程序：

（1）將15μlzui終洗脫體積分成兩部分：13μl與新制備的13μl10mg / ml TCEP（終體積=26μl，[TCEP] = 17.5mM）在室溫下反應(yīng)約16小時(shí)，同時(shí)在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中將2μl加載到凝膠上。

（2）使用HP 1050HPLC系統(tǒng)，將26μl以上的減少的IgG2a中的20μl注入到無(wú)孔聚苯乙烯二乙烯基苯反相（C-18）柱中。溶劑A（0.1％TFA的水溶液）和溶劑B（0.1％TFA的ACN溶液）之間的梯度為25％至75％，使用5分鐘。檢測(cè)：在214和280nm處的UV。

3. （3）在3.17和3.3分鐘左右洗脫兩個(gè)主要的IgG2a峰。這兩個(gè)峰下的面積在每種情況下從（3.13-3.5）分鐘積分，相應(yīng)的mAU在214nm記錄。
4. （4）在相同的反應(yīng)條件下，將TCEP處理的IgG2a標(biāo)準(zhǔn)物（注入量為1.08,2.16,4.32,6.48和8.64μg的FI TC-M Ab）加載到柱中并用作恢復(fù)計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

PhyNexus建議使用含有IgG的PhyTip入門(mén)試劑盒作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)驗(yàn)證PhyTip色譜柱在所有應(yīng)用中的使用。

純化和富集的樣品必須清晰，無(wú)顆粒物質(zhì)。強(qiáng)烈建議離心樣品，并使用PhyTip色譜柱前僅使用清澈的上清液。

運(yùn)輸和存儲(chǔ)

每包PhyTip色譜柱已經(jīng)制造并按照zui高標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了質(zhì)量控制，并運(yùn)送到保持盒中，以保持每個(gè)PhyTip色譜柱內(nèi)特定親和樹(shù)脂的完整性。本產(chǎn)品在環(huán)境溫度下運(yùn)輸，但收到時(shí)應(yīng)存放在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室冰箱中，溫度在4℃到8℃之間。

• 不要凍結(jié)或凍結(jié)。
• 不使用時(shí)，請(qǐng)將箱子的蓋子關(guān)好并密封好，存放在冰箱內(nèi)。
• 不要讓親和樹(shù)脂在干燥的環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間存放干燥。

當(dāng)從PhyNexus運(yùn)輸時(shí)，含有蛋白A的PhyTip色譜柱儲(chǔ)存在甘油中。

相關(guān)產(chǎn)品如下：

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